弥漫性内生型脑桥胶质瘤（DIPG）是一种致命的中枢神经系统肿瘤，中位生存期仅11个月。尽管CAR T细胞在儿童白血病治疗中取得了显著成效，但颅内CAR T细胞治疗DIPG仍处于发展初期。前期研究已设计出B7-H3 CAR T细胞并进行了初步探索，基于此，开展了本次BrainChild-03临床试验。
患者招募与治疗方案
患者招募：纳入23名年龄在1-26岁、确诊DIPG且完成标准放疗、符合一系列生理和实验室指标、签署知情同意的患者。
治疗方案：采用自体CD4和CD8 T细胞经慢病毒转导表达B7-H3特异性CAR，通过脑室内（ICV）给药，共设置4种剂量递增方案（DR1-DR4），在剂量限制毒性（DLT）观察期每14天给药一次，8周内完成，后续根据患者情况决定是否继续治疗，不进行预淋巴清除，治疗期间禁止同步肿瘤定向治疗。
检测指标与研究结果
检测指标：通过多种方式评估CAR T细胞治疗的可行性、安全性、耐受性、分布及患者生存情况，包括收集不良事件、进行影像学评估、检测脑脊液（CSF）中CAR T细胞及相关细胞因子等。
安全性：21名接受治疗的患者中，最常见的不良事件为头痛、恶心呕吐、疲劳和发热，多为1-2级，仅1例出现3级脑积水。唯一的剂量限制毒性为1例3岁患者的肿瘤内出血（4级）。未观察到免疫效应细胞相关神经毒性综合征，总体表明该治疗具有一定安全性。
临床结局：从入组到死亡的中位生存期为19.5个月，从首次CAR T细胞输注到死亡的中位生存期为10.7个月，有3名患者在诊断后44、45和52个月仍存活。治疗前未进展患者的中位生存期优于进展后治疗患者。影像学评估显示，1例患者部分缓解（PR），15例稳定疾病（SD），2例疾病进展（PD）。
CAR T细胞检测与细胞因子分析：在38.1%的CSF样本中检测到B7-H3 CAR T细胞，外周血中仅2例可检测到载体。细胞因子分析发现，首次CAR T输注后CXCL10、GM-CSF、IFNγ和TARC等显著升高，后续输注后CRP和SAA明显增加，支持局部CAR T细胞激活和细胞毒活性。
研究结论
该临床试验表明，重复ICV输注B7-H3 CAR T细胞治疗DIPG患者具有耐受性和可行性，虽为1期研究，其临床疗效仍需进一步在多中心2期试验中探究。后续将开展2期试验明确疗效，并进行临床前研究以增强CAR T细胞功能和寻找联合治疗方案。
超敏电化学发光分析技术Meso Scale Discovery（MSD）的应用
实验样本收集：18名可评估患者在第1和第2疗程中CAR T细胞输注前后的CSF样本，共105份。同时采集96份外周血样本用于对比分析，但外周血样本中仅2份检测到载体。
实验试剂与仪器：采用V-PLEX Plus Human Biomarker 54-Plex Kit（MesoScale Diagnostics，catalog number K15248G）试剂盒进行检测。使用预包被捕获抗体的96孔板，实验仪器包括MESO QuickPlex SQ 120等，并利用MSD Discovery Workbench version 4.0.13软件进行数据处理。
实验流程：
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样本处理：CSF样本经腰椎穿刺或脑室导管采集后，先在4°C保存，处理时先250 × g离心10 min去除细胞，再10,000 × g离心10 min去除残留碎片，取无细胞上清液分装并在-80°C冻存。使用前解冻，按照试剂盒说明书进行后续操作。除CXCL10和MCP-1按50倍稀释外，其余分析物按制造商建议稀释。
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检测步骤：用MSD Blocker A在室温下封闭96孔板1 h，洗涤后将稀释的标准品和样本重复加入相应孔中，4°C振荡孵育过夜。然后加入SULFO-TAG标记的检测抗体，室温孵育1-2 h，再次洗涤后用读板缓冲液显色，最后用MESO QuickPlex SQ 120仪器测量。
数据分析：
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标准曲线绘制：使用五参数逻辑模型生成标准曲线，根据标准曲线外推每个分析物的浓度，低于最低检测限（LLOD）的值视为未检测到。
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统计分析：在R软件中使用lme4、emmeans和EnhancedVolcano包进行相关细胞因子数据的统计分析。细胞因子水平重复测量，变异系数超过25%的样本被排除。采用线性混合效应模型评估输注前后时间点的差异，将研究参与者作为随机截距，log2转换后的细胞因子表达值作为响应变量，拟合单一模型评估所有细胞因子和时间点，并计算线性对比以评估特定时间点的输注前后差异。通过分析发现，首次CAR T输注后CXC趋化因子配体10（CXCL10）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、IFNγ和胸腺和激活调节趋化因子（TARC）等水平显著升高，后续输注后CRP和血清淀粉样蛋白A（SAA）明显增加，这些结果支持了局部CAR T细胞激活和细胞毒活性的结论。如果您对MSD电化学发光技术或相关检测方法有更多兴趣，欢迎了解MSD超敏高通量多因子分析系统，该系统提供了更全面和深入的技术信息。
