mRNA 疗法的迅猛发展，使其在医学领域备受瞩目，然而在大规模生产过程中却遭遇诸多挑战。其中，mRNA 加帽效率以及双链 RNA（dsRNA）副产物问题，成为影响疗法安全性和有效性的重要因素。现有加帽方法不仅成本高昂，而且难以实现大规模生产。而野生型 T7 RNA 聚合酶在体外转录（IVT）时产生的 dsRNA 副产物，更是可能引发免疫反应，且去除难度大。因此，开发新型 RNA 聚合酶迫在眉睫。
论文《An engineered T7 RNA polymerase for efficient co - transcriptional capping with reduced dsRNA byproducts in mRNA synthesis》发表于 Faraday Discussions，介绍了一种工程化 T7 RNA 聚合酶 T7 - 68。该聚合酶可显著提高 mRNA 合成中的共转录加帽效率，同时减少 dsRNA 副产物，从而简化 mRNA 生产流程。
本研究应用 Meso Scale Discovery（MSD）超高灵敏度电化学发光技术，精准检测极微量的 dsRNA。在 mRNA 合成研究中，准确检测 dsRNA 含量极为关键，因为即使是少量的 dsRNA，也可能引发免疫反应，进而影响 mRNA 疗法的安全性和有效性。基于 MSD 的 dsRNA ELISA 方法，能够精确量化 dsRNA，为评估不同 RNA 聚合酶转录产生的 dsRNA 水平提供了可靠数据，助力研究人员深入了解转录过程中的副产物情况。
具体实验方法如下 ：
-
准备工作 ：选用 MULTI - ARRAY Standard 96 孔板，在 4℃条件下，将 K1 抗 dsRNA 小鼠单克隆抗体包被在孔板上过夜。随后，用 5% MSD Blocker A 对孔板进行封闭，时长 1 小时。封闭后，洗涤孔板，为后续实验做好准备。
-
样本处理与孵育 ：将待检测的 mRNA 样本加入洗涤后的孔板中，在特定条件下孵育 90 分钟，确保 mRNA 样本中的 dsRNA 与孔板上的 K1 抗体充分结合。孵育结束后，再次洗涤孔板，去除未结合的杂质。
-
检测抗体孵育 ：向孔板中加入 K2 抗 dsRNA 抗体，在合适条件下孵育 1 小时。K2 抗体能与已结合在孔板上的 dsRNA 进一步结合，形成稳定的免疫复合物。孵育完成后，洗涤孔板，洗去未结合的 K2 抗体。
-
信号检测 ：加入 Sulfo tag 标记的大鼠抗小鼠 IgM 抗体，孵育 1 小时。该抗体可与 K2 抗体特异性结合，其带有的 Sulfo tag 标记能在后续检测中产生电化学发光信号。再次洗涤孔板，去除未结合的标记抗体，然后加入 MSD GOLD Read Buffer A。随后，将孔板放置在 MSD Quickplex SQ 120 仪器上进行读数，获取检测数据。最后，运用 MSD Discovery Workbench 软件对数据进行分析，从而确定 mRNA 样本中 dsRNA 的含量。
实验结果表明，通过 MSD 技术进行的 dsRNA ELISA 测定显示，T7 - 68 产生的总 dsRNA 比野生型 T7 聚合酶少 59 倍。
图 A 呈现了氯化锂沉淀（未纯化，crude）或 HPLC 纯化后的 mRNA 的分析型 HPLC 色谱图。横坐标为时间（分钟），纵坐标为吸光度（mAU）。图中绿色曲线代表 T7 - 68 聚合酶产生的 mRNA，蓝色曲线代表野生型 T7 聚合酶产生的 mRNA，黑色曲线代表经 HPLC 纯化后的野生型 T7 聚合酶产生的 mRNA。曲线经总强度归一化处理，以便比较保留时间更长的 3' 端延伸产物。从图中可以清晰看出，野生型 T7 聚合酶产生的 mRNA 在特定时间处的峰更为明显，而 T7 - 68 聚合酶产生的 mRNA 峰相对较弱，且经 HPLC 纯化后，野生型 T7 聚合酶产生的 mRNA 峰发生了变化。
图 B 则是利用 dsRNA 特异性夹心 ELISA 分析图 A 中 RNA 的总 dsRNA 含量，采用对数刻度绘制滴定系列曲线。横坐标为 RNA 浓度（μg/ml），纵坐标为 dsRNA ELISA 信号（RLU，相对光单位）。不同符号代表不同样本，包括 poly (I:C) 对照（黑色圆圈）、野生型 T7 聚合酶产生的未纯化 mRNA（白色方块）、野生型 T7 聚合酶产生并经 HPLC 纯化的 mRNA（黑色方块）以及 T7 - 68 聚合酶产生的未纯化 mRNA（白色圆圈）。在相同 RNA 浓度下，T7 - 68 聚合酶产生的 mRNA 的 dsRNA ELISA 信号低于野生型 T7 聚合酶产生的未纯化 mRNA，且接近甚至低于经 HPLC 纯化后的野生型 T7 聚合酶产生的 mRNA。
图 C 为 dsRNA ELISA 信号的线性图。横坐标是样本类型，纵坐标为 dsRNA ELISA 信号（10,000 x RLU）。在 RNA 上样量为 9 ng/μL 时，T7 - 68 聚合酶产生的 mRNA 的 dsRNA ELISA 信号显著低于野生型 T7 聚合酶产生的未纯化 mRNA，这有力地说明了 T7 - 68 聚合酶产生的 dsRNA 更少。
在细胞实验中，观察到野生型 T7 聚合酶产生的未纯化 mRNA 引发的 IFN 信号最强，经 HPLC 纯化后 IFN 信号有所减弱，而 T7 - 68 产生的未纯化 mRNA 引发的 IFN 信号则更低。此外，T7 - 68 产生的未纯化 mRNA 转染 HeLa 细胞后，GFP 表达比野生型 T7 聚合酶产生的 mRNA 高 8 倍。
综上所述，工程化的 T7 - 68 RNA 聚合酶凭借其卓越的性能，为 mRNA 生产领域带来了新的希望。它不仅提高了共转录加帽效率，还显著减少了 dsRNA 的形成，从而简化了 mRNA 的生产流程。这一创新成果，有望推动 mRNA 生产工艺迈向新的高度，为 mRNA 疗法的广泛应用铺平道路。如果您对MSD电化学发光技术或相关检测方法有更多兴趣，欢迎了解MSD超敏高通量多因子分析系统，该系统提供了更全面和深入的技术信息。
